Метод отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки

Освітлювали екстракт шляхом центрифугування за 15 000 об/хв протягом 20 хв. До надосадової рідини додавали краплями 20 %-ний розчин тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,5% та інкубували 30 хв., не застосовуючи на цьому етапі органічних розчинників, які різко знижують вихід вірусу [11, 12]. Додавання тритон-Х 100 зумовлює розчинення клітинних мембран і хлоропластів перед осадженням поліетиленгликолем (ТТЕГ).

Первинне концентрування вірусу проводили шляхом додавання до екстракту 20 %-ного розчину поліетиленгліколю (м.в. 40000) та NaCl до кінцевої концентрації 8 % та 1,5 %, відповідно. Витримували 1 годину при температурі +4 °С. Преципітат відділяли центрифугуванням за 6000 об/хв протягом 20 хв.

Після центрифугування при 6000 об/хв в надосадковій рідині вірус серологічно не виявлявся. Для повної екстракції вірусу необхідно було проводити декілька послідовних ресуспендувань осаду 0,01 М трис-гліциновим буфером, рН 8,3, кожен раз освітлюючи екстракт низькошвидкісним центрифугуванням. На цьому етапі загальний об'єм отриманого препарату вірусу не перевищував 1/10 від початкового об'єму рослинного екстракту.

Після осадження ПЕГ екстракція ХВК із преципітата, який містить значну кількість білків рослини-хазяїна, ускладнена. Це потребує застосування ряду циклів екстракції вірусу із осадів та контролю на кожному етапі для уникнення значної втрати вірусу. Екстракція МВК з осадів проходить більш ефективно, якщо для гомогенізації рослинної тканини використовувати трис-гліциновий буфер, а не фосфатний чи цитратний. При використанні трис-гліцинового буфера основна кількість вірусу екстрагується при перших двох етапах ресуспендування.

Остаточне очищення препарату ХВК здійснювали за допомогою приладу для препаративного електрофорезу із застосуванням 40%-ної сахарозної подушки.

При проведені препаративного електрофорезу ХВК необхідно було підібрати оптимальні умови для очищення вірусу: рН та іонну силу буферних розчинів, температурний режим, напругу електричного поля, тривалість, концентрацію сахарозної подушки, кількість антигену; який можна розділити [12].

Сконцентрований осадженням ПЕГ препарат вірусу нашаровували на 40%-у сахарозну подушку висотою 10 см та діаметром 1,5 см, яка була сформована в електрофоретичній колонці.

Електрофорез вели в лужній системі буферів за температури 16-20 °С, сили струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в протягом 3 годин.

При відпрацюванні цього етапу отримання препарату МВК виявили, що електрофорез в 40 % сахарозі є ефективним прийомом дляконцентрування ХВК та очищення його від рослинних компонентів.

В роботі ми використовували 0.01М трис-гліциновий буфер, рН 8,3, який найбільше підходить як для екстракції ХВК, так і для електрофорезу. Виходили з того, що буферний розчин, який використовується при електрофорезі, повинен мати низьку іонну силу (0,005-0,02), що дозволяє застосовувати високі градієнти напруги вздовж колонки при мінімальному утворенні тепла. Крім того, мають бути підібрані такі значення рН буферних розчинів, щоб різниця в зарядах між компонентами суміші, яка розділяється, була максимальною [7, 12].

Напругу поля належить підтримувати настільки високою, наскільки можливо за умов мінімального утворення та розсіювання тепла. При розробці нашого методу мінімальний нагрів і конвекцію спостерігали при силі струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в.

Подібні статті

Рослини – рятівники від радіації
Вплив рослин на організм людини Все живе на нашій планеті взаємно впливає один на одного. Тому вплив рослин на людський організм давно доведено. Серед судинних (вищих) рослин природної флори України й такі, введення яких в організм перед або під час ...

Геоботанічне районування України
Докладний аналіз різних факторів, що впливають на живі організми та угруповання їх, здійснюється в курсах екології та окремих біологічних дисциплін (ботаніки, зоології). Усі вони можуть виступати стосовно виду, що розселяється, або як пози ...